Η κρυο-EM μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των δομών μεγάλων μοριακών σύνθετων όπως το σύμπλεγμα αναγνώρισης προέλευσης (ORC).Το ΟΡΚ αναγνωρίζει και συνδέει το DNA για να ξεκινήσει τη διαδικασία που αντιγράφει το γενετικό υλικό του κυττάρου πριν από την κυτταρική διαίρεσηΧουίλιν Λι, Εθνικό Εργαστήριο Μπρούκχέιβεν, και Μπρους Στίλμαν, Εργαστήριο Χάλντ Σπρινγκ Χάρμπορ.

Τι είναι η κρυο-ΕΜ και πώς λειτουργεί;

Στην κρυο-ΜΕ, οι ερευνητές καταψύχνουν γρήγορα ένα κύτταρο, ιό, μοριακό σύμπλεγμα ή άλλη δομή έτσι ώστε τα μόρια νερού να μην έχουν χρόνο να σχηματίσουν κρύσταλλους.Οι επιστήμονες χρησιμοποιούν ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο για να ανατινάξουν το παγωμένο δείγμα με ακτίνα ηλεκτρονίωνΑυτό δημιουργεί μια διμερής προβολή του δείγματος σε ψηφιακό ανιχνευτή.Δημιουργώντας εκατοντάδες προβολές του δείγματος από πολλές διαφορετικές γωνίες και στη συνέχεια λαμβάνοντας το μέσο όρο αυτών των γωνιώνΟι πρόσφατες εξελίξεις στην κρυο-EM παρέχουν πολύ λεπτομερείς εικόνες πρωτεϊνών και άλλων βιολογικών δομών.συμπεριλαμβανομένων των μεγαλύτερων δομών, όπως τα συμπλέγματα RNA-πρωτεΐνης.

Εισαγωγή της κρυογενούς ηλεκτρονικής μικροσκόπησης (Cryo-EM):

Κατά την τελευταία δεκαετία, η κρυογενής μικροσκόπηση ηλεκτρονίων (κρυο-EM) έχει αντικαταστήσει όλο και περισσότερο τις παραδοσιακές μεθόδους προετοιμασίας δειγμάτων για την ηλεκτρονική μικροσκόπηση.Ήταν η πρωτοποριακή εργασία των Taylor και Glaeser και του Dubochet και των συναδέλφων που άνοιξε το δρόμο για αυτή την ανάπτυξη, το οποίο παρουσίασε ένα κβαντικό άλμα της βιολογικής μικροσκόπησης ηλεκτρονίων, καθώς επέτρεψε να ληφθούν εικόνες από πλήρως υδατισμένα δείγματα σε κατάσταση κοντά στην εγγενή.

Ο όρος "κρυο-EM" αναφέρεται σε διάφορες μορφές ηλεκτρονικής μικροσκοπικής απεικόνισης μετάδοσης όταν εφαρμόζεται σε δείγματα που ενσωματώνονται σε γυάλινο πάγο.Τρεις κύριοι κλάδοι της κρυο-EM είναι σημαντικοί στο πλαίσιο της μοριακής δομικής βιολογίας- Η ηλεκτρονική κρυσταλλογραφία, η ανάλυση μεμονωμένων σωματιδίων και η ηλεκτρονική τομογραφία.

Η ηλεκτρονική κρυσταλλογραφία προσφέρει το πλεονέκτημα για τον προσδιορισμό της δομής των πρωτεϊνών που σχηματίζουν 2D-κρυστάλλους κάτω από 4Å (π.χ. όπως φαίνεται με τις πρωτεΐνες μεμβράνης μεταφοράς νερού - aquaporins).Οι πρωτεΐνες μεμβράνης είναι ιδιαίτερα ελπιδοφόροι υποψήφιοι για τη δημιουργία 2D κρυστάλλωνΟι διακρίσεις άνω των 2 Å έχουν ληφθεί. three dimensional electron crystallography of protein microcrystals (microED) has been developed and is showing promises in solving high resolutions structures of proteins forming tiny 3D-crystals (200 nm) usually not amenable for study by x-ray crystallography.

Η ανάλυση μεμονωμένων σωματιδίων χρησιμοποιείται για απομονωμένες και καθαρισμένες μεγαλύτερες συγκεντρώσεις πολλαπλών υπομονάδων που είναι συχνά πολύ ετερογενείς, μετασταθερές και εξαιρετικά δύσκολο να κρυσταλλωθούν (π.χ.το ριβοσόμιο ή το πρωτεασόμιο 26S) σε ρουτίνα ανάλυση 3 ∆10 Å και στις καλύτερες περιπτώσεις κάτω από 2 ÅΠεριοχή μεγέθους δείγματος: 5-150 nm.

Τι είναι η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ και πώς λειτουργεί;

Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ρίχνει μια δέσμη ακτίνων Χ μέσα από ένα μικρό στερεό κρύσταλλο που αποτελείται από τρισεκατομμύρια πανομοιότυπα μόρια πρωτεϊνών.παρόμοιο με τον τρόπο που οι εικόνες καταγράφονται σε μια ψηφιακή κάμεραΈνας υπολογιστής μετρά την ένταση των διασκορπισμένων ακτίνων Χ για να ορίσει μια θέση σε κάθε άτομο στο κρυσταλλωμένο μόριο.Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για να προσδιοριστεί πάνω από το 85 τοις εκατό των γνωστών δομών των πρωτεϊνών.

Μερικές λεπτομέρειες σχετικά με την ακτινογραφία ακτίνων Χ και την κρυο-ΕΜ:

1Οι μικρές πρωτεΐνες είναι πιο κατάλληλες για κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, καθώς μπορεί να είναι δύσκολο να διακρίνονται από την κρυο-EM.

2Η κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ μπορεί να επιτύχει πολύ υψηλές ανάλυσεις, αν και τα τελευταία χρόνια η κρυο-EM έχει συγκρίσιμα αποτελέσματα.

3Οι μεγάλες δομές, τα σύνθετα και οι πρωτεΐνες μεμβράνης μπορεί να είναι δύσκολο να κρυσταλλωθούν.

4Η EM (αρνητική χρώση) προσφέρει ταχεία ανίχνευση των δειγμάτων για να αποκλειστεί η συγκέντρωση και να προσδιοριστεί η ολιγομερισμός, παρέχοντας μια οπτική εικόνα του πώς συμπεριφέρεται το δείγμα και τι περιέχει.

5Η κρυο-EM απαιτεί μικρότερες ποσότητες πρωτεΐνης από την κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ. Η μέθοδος αυτή μπορεί να ωφελήσει δείγματα με απόδοση κάτω των 2 mg πρωτεΐνης (< 5-10 mg/ml).*

Κρυο-ΕΜ πεπτίδιο KS-VΠλατφόρμα υπηρεσιών:

• Ελέγχος αρνητικών χρωμάτων και υπολογισμός 2D ταξινόμησης
• Προετοιμασία δειγμάτων από κατεψυγμένα πλέγματα και έλεγχο της κατάστασης
• Συλλογή δεδομένων υψηλής ανάλυσης και 3D ανακατασκευή, μοντελοποίηση